Tekuća hromatografija je glavna metoda za ispitivanje sadržaja svake komponente i nečistoća u sirovinama, međuproizvodima, preparatima i materijalima za pakovanje, ali mnoge supstance nemaju standardne metode na koje se mogu osloniti, pa je neizbežno razvijati nove metode. U razvoju metoda tekuće faze, hromatografska kolona je jezgro tečne hromatografije, tako da je ključno kako odabrati odgovarajuću hromatografsku kolonu. U ovom članku autor će objasniti kako odabrati kolonu za tečnu hromatografiju iz tri aspekta: ukupne ideje, razmatranja i opseg primjene.
A. Opšte ideje za odabir kolona za tečnu hromatografiju
1. Procijenite fizička i hemijska svojstva analita: kao što su hemijska struktura, rastvorljivost, stabilnost (kao što je da li se lako oksidira/reducira/hidrolizira), kiselost i alkalnost, itd., posebno je hemijska struktura ključna faktor u određivanju svojstava, kao što je konjugirana grupa ima jaku ultraljubičastu apsorpciju i jaku fluorescenciju;
2. Odredite svrhu analize: da li je potrebno visoko odvajanje, visoka efikasnost kolone, kratko vrijeme analize, visoka osjetljivost, otpornost na visoki pritisak, dug vijek trajanja kolone, niska cijena itd.;
- Odaberite odgovarajuću hromatografsku kolonu: razumite sastav, fizička i kemijska svojstva hromatografskog punila, kao što su veličina čestica, veličina pora, temperaturna tolerancija, tolerancija pH, adsorpcija analita, itd.
- Razmatranja za odabir kolona za tečnu hromatografiju
Ovo poglavlje govori o faktorima koje treba uzeti u obzir pri odabiru kolone za hromatografiju iz perspektive fizičkih i hemijskih svojstava same hromatografske kolone. 2.1 Matrica punila
2.1.1 Matrica silika gela Matrica za punjenje većine kolona tečne hromatografije je silika gel. Ova vrsta punila ima visoku čistoću, nisku cijenu, visoku mehaničku čvrstoću i lako je modificirati grupe (kao što su fenilna veza, amino veza, cijano veza, itd.), ali pH vrijednost i temperaturni raspon koji toleriše su ograničeni: pH raspon većine punila silika gela je 2 do 8, ali pH raspon posebno modificiranih faza vezanih na silika gel može biti širok i od 1,5 do 10, a postoje i posebno modificirane faze vezane za silika gel koje su stabilne pri niskom pH, kao što je Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, koji je stabilan na pH 1 do 8; gornja temperaturna granica matrice silika gela je obično 60 ℃, a neke kolone za hromatografiju mogu tolerisati temperaturu od 40 ℃ pri visokom pH.
2.1.2 Polimerna matrica Polimerna punila su uglavnom polistiren-divinilbenzen ili polimetakrilat. Njihove prednosti su što podnose širok raspon pH vrijednosti – mogu se koristiti u rasponu od 1 do 14, a otporniji su na visoke temperature (mogu doseći i iznad 80 °C). U poređenju sa C18 punilima na bazi silicijuma, ova vrsta punila ima jaču hidrofobnost, a makroporozni polimer je veoma efikasan u odvajanju uzoraka kao što su proteini. Njegovi nedostaci su što je efikasnost kolone niža i mehanička čvrstoća slabija od punila na bazi silicijum dioksida. 2.2 Oblik čestica
Većina modernih HPLC punila su sferične čestice, ali ponekad su nepravilne čestice. Sferične čestice mogu osigurati niži pritisak u koloni, veću efikasnost kolone, stabilnost i duži vijek trajanja; kada se koriste visokoviskozne mobilne faze (kao što je fosforna kiselina) ili kada je otopina uzorka viskozna, nepravilne čestice imaju veću specifičnu površinu, što je pogodnije za puno djelovanje dvije faze, a cijena je relativno niska. 2.3 Veličina čestica
Što je manja veličina čestica, to je veća efikasnost kolone i veća separacija, ali je otpornost na visoki pritisak lošija. Najčešće korištena kolona je kolona veličine čestica od 5 μm; ako je zahtjev za odvajanjem visok, može se odabrati punilo od 1,5-3 μm, što je pogodno za rješavanje problema separacije nekih složenih matričnih i višekomponentnih uzoraka. UPLC može koristiti punila od 1,5 μm; Za polupreparativne ili preparativne kolone često se koriste punila veličine čestica veličine 10 μm ili veće. 2.4 Sadržaj ugljika
Sadržaj ugljika se odnosi na udio vezane faze na površini silika gela, koji je povezan sa specifičnom površinom i pokrivenošću vezanom fazom. Visok sadržaj ugljika pruža visok kapacitet kolone i visoku rezoluciju i često se koristi za složene uzorke koji zahtijevaju visoko odvajanje, ali zbog dugog vremena interakcije između dvije faze, vrijeme analize je dugo; Kromatografske kolone sa niskim sadržajem ugljika imaju kraće vrijeme analize i mogu pokazati različite selektivnosti, a često se koriste za jednostavne uzorke koji zahtijevaju brzu analizu i uzorke koji zahtijevaju visoke uslove vodene faze. Općenito, sadržaj ugljika u C18 kreće se od 7% do 19%. 2.5 Veličina pora i specifična površina
HPLC adsorpcioni mediji su porozne čestice i većina interakcija se odvija u porama. Stoga molekuli moraju ući u pore da bi se adsorbirali i odvojili.
Veličina pora i specifična površina su dva komplementarna koncepta. Mala veličina pora znači veliku specifičnu površinu, i obrnuto. Velika specifična površina može povećati interakciju između molekula uzorka i vezanih faza, poboljšati zadržavanje, povećati opterećenje uzorka i kapacitet kolone, te odvajanje složenih komponenti. Potpuno porozna punila spadaju u ovu vrstu punila. Za one sa visokim zahtjevima za odvajanjem, preporučuje se odabir punila sa velikom specifičnom površinom; mala specifična površina može smanjiti protivpritisak, poboljšati efikasnost kolone i smanjiti vrijeme ravnoteže, što je pogodno za analizu gradijenta. Jezgro-ljuska punila spadaju u ovu vrstu punila. Uz pretpostavku osiguravanja razdvajanja, preporučuje se odabir punila sa malom specifičnom površinom za one sa visokim zahtjevima efikasnosti analize. 2.6 Volumen pora i mehanička čvrstoća
Volumen pora, poznat i kao "volumen pora", odnosi se na veličinu zapremine praznine po jedinici čestice. Može dobro odražavati mehaničku čvrstoću punila. Mehanička čvrstoća punila s velikim volumenom pora je nešto slabija od punila s malim volumenom pora. Za HPLC separaciju se uglavnom koriste punila sa zapreminom pora manjim od ili jednakim 1,5 mL/g, dok se punila sa zapreminom pora većim od 1,5 mL/g uglavnom koriste za molekularnu ekskluzijsku hromatografiju i hromatografiju niskog pritiska. 2.7 Stopa zatvaranja
Zatvaranje može smanjiti vršne vrhove uzrokovane interakcijom između spojeva i izloženih silanolnih grupa (kao što je ionska veza između alkalnih jedinjenja i silanolnih grupa, van der Waalsove sile i vodonične veze između kiselih spojeva i silanolnih grupa), čime se poboljšava efikasnost kolone i oblik vrha . Nezatvorene vezane faze će proizvesti različite selektivnosti u odnosu na zatvorene vezane faze, posebno za polarne uzorke.
- Opseg primjene različitih kolona tečne hromatografije
Ovo poglavlje će opisati opseg primjene različitih tipova kolona tečne hromatografije kroz neke slučajeve.
3.1 Reverzna faza C18 hromatografske kolone
Kolona C18 je najčešće korištena kolona obrnute faze, koja može zadovoljiti testove sadržaja i nečistoća većine organskih supstanci, a primjenjiva je na srednje polarne, slabo polarne i nepolarne tvari. Tip i specifikacija C18 hromatografske kolone treba izabrati u skladu sa specifičnim zahtevima za odvajanje. Na primjer, za tvari s visokim zahtjevima za odvajanjem, često se koriste specifikacije 5 μm*4,6 mm*250 mm; za supstance sa složenim matricama za razdvajanje i sličnim polaritetom, mogu se koristiti specifikacije 4 μm*4,6 mm*250 mm ili manje veličine čestica. Na primjer, autor je koristio kolonu od 3 μm*4,6 mm*250 mm za detekciju dvije genotoksične nečistoće u API-ju celekoksiba. Razdvajanje ove dvije supstance može dostići 2,9, što je odlično. Osim toga, pod pretpostavkom da se osigura razdvajanje, ako je potrebna brza analiza, često se bira kratka kolona od 10 mm ili 15 mm. Na primjer, kada je autor koristio LC-MS/MS za detekciju genotoksične nečistoće u piperakin fosfatu API, korištena je kolona od 3 μm*2,1 mm*100 mm. Razmak između nečistoće i glavne komponente bio je 2,0, a detekcija uzorka se može završiti za 5 minuta. 3.2 Fenil kolona obrnute faze
Fenil kolona je također vrsta kolone obrnute faze. Ova vrsta kolone ima jaku selektivnost za aromatična jedinjenja. Ako je odziv aromatičnih jedinjenja izmeren običnom C18 kolonom slab, možete razmisliti o zameni fenil kolone. Na primjer, kada sam pravio celekoksib API, odgovor glavne komponente izmjeren fenil kolonom istog proizvođača i iste specifikacije (svih 5 μm*4,6 mm*250 mm) bio je oko 7 puta veći od stupca C18. 3.3 Kolona normalne faze
Kao efikasan dodatak koloni obrnute faze, kolona normalne faze je pogodna za visoko polarna jedinjenja. Ako je vrh još uvijek vrlo brz kada se eluira s više od 90% vodene faze u koloni obrnute faze, pa čak i blizu vrha rastvarača i preklapa se s vrhom rastvarača, možete razmisliti o zamjeni kolone normalne faze. Ova vrsta kolone uključuje hilic kolonu, amino kolonu, cijano kolonu itd.
3.3.1 Hilic kolona Hilic kolona obično ugrađuje hidrofilne grupe u vezani alkil lanac kako bi se poboljšao odgovor na polarne supstance. Ova vrsta kolone je pogodna za analizu šećernih supstanci. Autor je ovu vrstu kolone koristio kada je radio sadržaj i srodne supstance ksiloze i njenih derivata. Izomeri derivata ksiloze takođe mogu biti dobro razdvojeni;
3.3.2 Amino kolona i cijano kolona Amino kolona i cijano kolona odnose se na uvođenje amino i cijano modifikacija na kraju vezanog alkil lanca, respektivno, radi poboljšanja selektivnosti za posebne supstance: na primjer, amino kolona je dobar izbor za odvajanje šećera, aminokiselina, baza i amida; cijano kolona ima bolju selektivnost pri odvajanju hidrogeniranih i nehidrogeniranih strukturno sličnih supstanci zbog prisustva konjugiranih veza. Amino kolona i cijano kolona se često mogu prebacivati između kolone normalne faze i kolone obrnute faze, ali se često mijenjanje ne preporučuje. 3.4 Kiralni stupac
Kiralna kolona, kao što samo ime govori, pogodna je za odvajanje i analizu kiralnih spojeva, posebno u oblasti farmaceutskih proizvoda. Ovaj tip kolone se može uzeti u obzir kada konvencionalne kolone sa reverznom fazom i kolone normalne faze ne mogu postići razdvajanje izomera. Na primjer, autor je koristio kiralnu kolonu od 5 μm*4,6 mm*250 mm da odvoji dva izomera 1,2-difeniletilendiamina: (1S, 2S)-1, 2-difeniletilendiamin i (1R, 2R)-1,2 -difeniletilendiamin, a razmak između njih je dostigao oko 2,0. Međutim, kiralne kolone su skuplje od drugih tipova kolona, obično 1W+ po komadu. Ako postoji potreba za takvim kolonama, jedinica treba da napravi dovoljan budžet. 3.5 Kolona ionske izmjene
Kolone za ionsku izmjenu su pogodne za odvajanje i analizu nabijenih jona, kao što su joni, proteini, nukleinske kiseline i neke supstance šećera. Prema vrsti punila, dijele se na kolone za kationsku izmjenu, kolone za anjonsku izmjenu i kolone za jaku kationsku izmjenu.
Kolone za kationsku izmjenu uključuju kolone na bazi kalcija i vodonika, koje su uglavnom pogodne za analizu kationskih supstanci kao što su aminokiseline. Na primjer, autor je koristio kolone na bazi kalcija kada je analizirao kalcijum glukonat i kalcijum acetat u rastvoru za ispiranje. Obe supstance su imale jake reakcije na λ=210nm, a stepen razdvajanja je dostigao 3,0; autor je koristio kolone na bazi vodika kada je analizirao supstance povezane sa glukozom. Nekoliko glavnih srodnih supstanci – maltoza, maltotrioza i fruktoza – imale su visoku osjetljivost pod diferencijalnim detektorima, s granicom detekcije od čak 0,5 ppm i stepenom odvajanja od 2,0-2,5.
Kolone za anionsku izmjenu su uglavnom pogodne za analizu anjonskih supstanci kao što su organske kiseline i halogeni joni; Kolone za jaku katjonsku izmjenu imaju veći kapacitet izmjene jona i selektivnost, te su pogodne za odvajanje i analizu složenih uzoraka.
Gore navedeno je samo uvod u tipove i opsege primjene nekoliko uobičajenih kolona za tečnu hromatografiju u kombinaciji s vlastitim iskustvom autora. Postoje i druge posebne vrste hromatografskih kolona u stvarnim aplikacijama, kao što su hromatografske kolone sa velikim porama, hromatografske kolone sa malim porama, kolone za afinitetnu hromatografiju, multimodne hromatografske kolone, kolone za tečnu hromatografiju ultra visokih performansi (UHPLC), kolone za superkritičnu fluidnu hromatografiju ( SFC), itd. Oni igraju važnu ulogu u različitim oblastima. Specifičan tip hromatografske kolone treba odabrati prema strukturi i svojstvima uzorka, zahtjevima za odvajanje i drugim svrhama.
Vrijeme objave: Jun-14-2024