Principi i metode kvantitativne analize tečnom hromatografijom

Mehanizam razdvajanja tečne hromatografije zasniva se na razlici u afinitetu komponenti u smeši za dve faze.

Prema različitim stacionarnim fazama, tečna hromatografija se deli na tečno-čvrstu hromatografiju, tečno-tečnu hromatografiju i hromatografiju vezane faze.Najrasprostranjenije su tečno-čvrsta hromatografija sa silika gelom kao punilom i hromatografija vezane faze sa mikrosilikom kao matriksom.

Prema obliku stacionarne faze, tečna hromatografija se može podeliti na hromatografiju na koloni, papirnu hromatografiju i tankoslojnu hromatografiju.Prema kapacitetu adsorpcije, može se podijeliti na adsorpcionu hromatografiju, particionu hromatografiju, hromatografiju za izmjenu jona i hromatografiju gel permeacije.

Poslednjih godina, sistem protoka tečnosti pod visokim pritiskom dodat je sistemu tečne kolonske hromatografije kako bi mobilna faza brzo tekla pod visokim pritiskom kako bi se poboljšao efekat separacije, tako da je tečna hromatografija visoke efikasnosti (takođe poznata kao visokotlačna) se pojavio.

PART
01 Princip kvantitativne analize tečne hromatografije

Za kvantificiranje na osnovu kvalitativnih, potrebne su čiste supstance kao standardi;

Kvantifikacija tečnom hromatografijom je relativno kvantitativna metoda: to jest, količina analita u smjesi se procjenjuje iz poznate količine čistog standardnog uzorka

PART
02 Osnova za kvantifikaciju tečnom hromatografijom

Količina izmjerene komponente (W) je proporcionalna vrijednosti odziva (A) (visina vrha ili površina vrha), W=f×A.

Kvantitativni faktor korekcije (f): To je konstanta proporcionalnosti formule kvantitativnog proračuna, a njeno fizičko značenje je količina mjerene komponente predstavljena jediničnom vrijednošću odgovora (površina vrha).

Kvantitativni faktor korekcije može se dobiti iz poznate količine standardnog uzorka i njegove vrijednosti odgovora.

Izmjerite vrijednost odgovora nepoznate komponente, a količina komponente se može dobiti kvantitativnim faktorom korekcije.

PART
03 Uobičajeni pojmovi u kvantitativnoj analizi

Uzorak (uzorak): otopina koja sadrži analit za hromatografsku analizu.Podijeljen na standardne i nepoznate uzorke.

Standard: Čist proizvod sa poznatom koncentracijom.Nepoznati uzorak (nepoznato): Smjesa čija koncentracija se ispituje.

Težina uzorka: Originalno vaganje uzorka koji se testira.

Dilution: Faktor razblaženja nepoznatog uzorka.

Komponenta: hromatografski pik koji se kvantitativno analizira, odnosno analit čiji je sadržaj nepoznat.

Količina komponente (količina): sadržaj (ili koncentracija) supstance koja se ispituje.

Integerity : Računski proces mjerenja površine pika hromatografskog pika pomoću računara.

Kalibraciona kriva: Linearna kriva sadržaja komponente u odnosu na vrednost odgovora, utvrđena iz poznate količine standardne supstance, koja se koristi za određivanje nepoznatog sadržaja analita.

PART
04 Kvantitativna analiza tečne hromatografije

1. Odaberite kromatografsku metodu prikladnu za kvantitativnu analizu:

l Potvrdite vrh otkrivene komponente i postignite rezoluciju (R) veću od 1,5

l Odredite konzistenciju (čistoću) hromatografskih pikova testiranih komponenti

l Odrediti granicu detekcije i granicu kvantifikacije metode;osjetljivost i linearni raspon

2. Uspostavite kalibracijsku krivu sa standardnim uzorcima različitih koncentracija

3. Provjerite tačnost i preciznost kvantitativnih metoda

4. Koristite odgovarajući softver za upravljanje hromatografijom za implementaciju prikupljanja uzoraka, obrade podataka i izvještaja o rezultatima

PART
05 Identifikacija kvantitativnih pikova (kvalitativnih)

Kvalitativno identificirati svaki hromatografski pik koji treba kvantificirati

Prvo koristite standardni uzorak da odredite vrijeme zadržavanja (Rt) hromatografskog pika koji treba kvantificirati.Upoređujući vrijeme retencije, pronađite komponentu koja odgovara svakom kromatografskom piku u nepoznatom uzorku.Kromatografska kvalitativna metoda je poređenje vremena zadržavanja sa standardnim uzorkom.Kriterijum nedovoljandaljnja potvrda (kvalitativno)

1. Standardna metoda sabiranja

2. Koristite druge metode u isto vrijeme: druge hromatografske metode (promijenite mehanizam, kao što je: korištenje različitih hromatografskih kolona), druge detektore (PDA: poređenje spektra, pretraživanje biblioteke spektra; MS: analiza masenog spektra, pretraga biblioteke spektra)

3. Drugi instrumenti i metode

PART
06 Potvrda kvantitativne vršne konzistencije

Potvrdite konzistenciju hromatografskog vrha (čistoće)

Uvjerite se da postoji samo jedna mjerena komponenta ispod svakog hromatografskog vrha

Provjerite ima li smetnji od koeluirajućih supstanci (nečistoće)

Metode za potvrdu konzistencije kromatografskog vrha (čistoće)

Poređenje spektrograma sa fotodiodnim matričnim (PDA) detektorima

Identifikacija vrhunske čistoće

2996 Teorija ugla čistoće

Kvantitativne metode koje se obično koriste u DJELU 07

Metoda standardne krive, podijeljena na eksternu standardnu ​​metodu i metodu internog standarda:

1. Eksterni standardni metod: najčešće se koristi u tečnoj hromatografiji

Serija standardnih uzoraka poznatih koncentracija je pripremljena koristeći čiste uzorke jedinjenja koja se testiraju kao standardni uzorci.ubrizgan u kolonu do njegove vrijednosti odgovora (vršna površina).
Unutar određenog raspona postoji dobar linearni odnos između koncentracije standardnog uzorka i vrijednosti odgovora, odnosno W= f×A , i napravljena je standardna kriva.

Pod potpuno istim eksperimentalnim uslovima, ubrizgajte nepoznati uzorak da biste dobili vrednost odgovora komponente koja se meri.Prema poznatom koeficijentu f može se dobiti koncentracija komponente koja se mjeri.

Prednosti eksterne standardne metode:jednostavan rad i proračun, to je uobičajena kvantitativna metoda;nema potrebe da se svaka komponenta detektuje i eluira;potreban je standardni uzorak;uslovi mjerenja standardnog uzorka i nepoznatog uzorka trebaju biti konzistentni;zapremina injekcije treba da bude precizna.

Nedostaci metode eksternog standarda:Eksperimentalni uslovi moraju biti visoki, kao što su osetljivost detektora, brzina protoka i sastav mobilne faze ne mogu se menjati;zapremina svake injekcije treba da ima dobru ponovljivost.

2. Metoda internog standarda: tačan, ali problematičan, najčešće se koristi u standardnim metodama

Poznata količina internog standarda se dodaje standardu kako bi se napravio mješoviti standard i priprema se serija radnih standarda poznate koncentracije.Molarni odnos standarda prema internom standardu u mešovitom standardu ostaje nepromenjen.Injektirajte u hromatografsku kolonu i uzmite (površina pika standardnog uzorka/područje unutrašnjeg standardnog uzorka) kao vrijednost odgovora.Prema linearnom odnosu između vrijednosti odziva i koncentracije radnog standarda, odnosno W= f×A , napravljena je standardna kriva.

Poznata količina internog standarda se dodaje nepoznatom uzorku i ubrizgava u kolonu kako bi se dobila vrijednost odgovora komponente koja se mjeri.Prema poznatom koeficijentu f može se dobiti koncentracija komponente koja se mjeri.

Karakteristike metode internog standarda:Tokom operacije, uzorak i interni standard se miješaju zajedno i ubrizgavaju u hromatografsku kolonu, tako da sve dok je odnos količine mjerene komponente i internog standarda u pomiješanoj otopini konstantan, promjena zapremine uzorka neće uticati na kvantitativne rezultate..Metoda internog standarda nadoknađuje utjecaj volumena uzorka, pa čak i mobilne faze i detektora, pa je preciznija od metode eksternog standarda.

PART
08 Faktori koji utječu na rezultate kvantitativne analize

Loša preciznost može biti uzrokovana:

Pogrešna integracija površine vrha, raspadanje uzorka ili nečistoće unesene tokom pripreme uzorka, bočica sa uzorkom nije zatvorena, isparavanje uzorka ili rastvarača, pogrešna priprema uzorka, problemi ubrizgavanja uzorka, pogrešna priprema internog standarda

Mogući razlozi za lošu preciznost:

Neispravna integracija vrha, problemi ubrizgavanja ili injektora, raspadanje uzorka ili nečistoće unesene tokom pripreme uzorka, hromatografski problemi, degradirani odgovor detektora