hromatografija, poznata i kao "hromatografska analiza", "hromatografija", je metoda razdvajanja i analize, koja ima veoma širok spektar primena u analitičkoj hemiji, organskoj hemiji, biohemiji i drugim oblastima.
Osnivač hromatografije je ruski botaničar M.Tsvetter.Godine 1906. ruski botaničar Zvetter objavio je rezultate svog eksperimenta: Kako bi odvojio biljne pigmente, izlio je ekstrakt petrolej etera koji sadrži biljne pigmente u staklenu epruvetu koja je sadržavala prah kalcijum karbonata i eluirao petroleterom od vrha do dna.Budući da različiti pigmenti imaju različite kapacitete adsorpcije na površini čestica kalcijum karbonata, u procesu ispiranja različiti pigmenti se kreću različitim brzinama prema dolje, formirajući tako trake različitih boja.Komponente pigmenta su odvojene.On je ovu metodu razdvajanja nazvao hromatografija.
Šematski prikaz eksperimenta odvajanja pigmenta listova biljke
Kontinuiranim razvojem metoda razdvajanja, sve više bezbojnih supstanci postaju predmet razdvajanja, hromatografija je takođe postepeno gubila značenje "boje", ali je naziv u upotrebi i danas.
Kromatografska klasifikacija
Suština kromatografije je proces u kojem se molekule koje treba odvojiti dijele i balansiraju između stacionarne i mobilne faze.Različite tvari su različito podijeljene između dvije faze, što ih čini različitim brzinama s mobilnom fazom.Kretanjem mobilne faze, različite komponente u smjesi se odvajaju jedna od druge na stacionarnoj fazi.Ovisno o mehanizmu, može se podijeliti u različite kategorije.
1, prema dvofaznoj klasifikaciji fizičkog stanja
Mobilna faza: plinska hromatografija, tečna hromatografija, superkritična fluidna hromatografija
Stacionarna faza: gas-čvrsto stanje, gas-tečnost;Tečnost-čvrsto, tečno-tečno
2, prema obliku klasifikacije stacionarnih faza
Kromatografija na koloni: hromatografija na pakovanoj koloni, hromatografija na kapilarnoj koloni, kromatografija na mikropakovanoj koloni, preparativna hromatografija
Ravna hromatografija: papirna hromatografija, tankoslojna hromatografija, hromatografija na polimernoj membrani
3, klasificiran prema mehanizmu razdvajanja
Adsorpciona hromatografija: Različite komponente se odvajaju prema njihovom adsorpcionom i desorpcionom kapacitetu na adsorbentima
Particiona hromatografija: Različite komponente se odvajaju prema njihovoj rastvorljivosti u rastvaraču
Molekularna ekskluziona hromatografija: prema veličini molekularne veličine odvajanja u ionskoj izmjenjivačkoj kromatografiji: različite komponente afiniteta za odvajanje smole s ionskom izmjenom
Afinitetna kromatografija: razdvajanje korištenjem prisustva specifičnog afiniteta između bioloških makromolekula
Kapilarna elektroforeza: komponente su razdvojene prema razlikama u pokretljivosti i/ili ponašanju podjele
Kiralna hromatografija se koristi za odvajanje i analizu kiralnih lijekova, koji se mogu podijeliti u tri kategorije: metoda kiralne derivatizacije reagensa;Metoda aditiva kiralne mobilne faze;Metoda kiralne stacionarne faze
Osnovna terminologija za hromatografiju
Krivulje dobivene iscrtavanjem signala odgovora komponenti nakon detekcije hromatografskog razdvajanja u odnosu na vrijeme nazivaju se hromatogrami.
Polazna linija:Pod određenim hromatografskim uslovima, kriva signala koji se generiše kada samo mobilna faza prolazi kroz detektorski sistem naziva se bazna linija, kao što je prikazano na ot liniji.Kada je eksperimentalno stanje bilo stabilno, osnovna linija je bila linija paralelna s horizontalnom osom.Osnovna linija odražava šum instrumenta, uglavnom detektora, tokom vremena.
Visina vrha:vertikalna udaljenost između tačke hromatografskog vrha i osnovne linije, označena sa h, kao što je prikazano na AB 'liniji.
Širina regije:Širina regiona hromatografskog pika je direktno povezana sa efikasnošću razdvajanja.Postoje tri metode za opisivanje širine hromatografskog pika: standardna devijacija σ, širina pika W i FWHM W1/2.
Standardna devijacija (σ):σ je polovično rastojanje između dvije tačke pregiba na krivulji normalne distribucije, a vrijednost σ označava stepen disperzije komponenti dalje od stuba.Što je veća vrijednost σ, to su komponente efluenta raspršenije, a efekt separacije je lošiji.Nasuprot tome, otpadne komponente su koncentrisane i efekat odvajanja je dobar.
Širina vrha W:Tačke preseka na obe strane hromatografskog vrha koriste se kao tangente, a presek na baznoj liniji naziva se širina pika ili širina osnovne linije, koja se takođe može izraziti kao W, kao što je prikazano na slici IJ.Prema principu normalne distribucije, odnos između širine vrha i standardne devijacije može se dokazati kao W=4σ.
W1/2:Širina vrha na polovini visine vrha naziva se FWHM, kao što je prikazano za udaljenost GH.W1/2=2,355σ, W=1,699W1/2.
W1/2, W oba su izvedena iz σ i koriste se za izračunavanje površina pikova uz mjerenje efekta stupca.FWHM mjerenje je praktičnije i najčešće se koristi.
kratak sažetak
Iz hromatografske krivulje vršnog protoka mogu se postići sljedeći ciljevi:
a, Kvalitativna analiza je izvršena na osnovu retencione vrednosti hromatografskih pikova
b, kvantitativna analiza na osnovu površine ili vrha hromatografskog pika
C. Efikasnost odvajanja kolone procijenjena je prema vrijednosti zadržavanja i širini vrha hromatografskog pika
Proračunska formula uključena u hromatografiju
1. Vrijednost zadržavanja
Vrijednost zadržavanja je parametar koji se koristi za opisivanje stepena do kojeg je komponenta uzorka zadržana u koloni i koristi se kao indikator hromatografske karakterizacije.Način njegovog predstavljanja je sljedeći:
Vrijeme zadržavanja tR
Vrijeme smrtitM
Podesite vrijeme zadržavanja tR'=tR-tM
(Ukupno vrijeme provedeno u stacionarnoj fazi)
Volumen zadržavanja
VR=tR*F. (neovisno o brzini mobilne faze)
Mrtva jačina zvuka
VM=tM*Fc
(Prostor koji ne zauzima stacionarna faza na putu protoka od injektora do detektora)
Podesite volumen zadržavanja VR'=t'R*Fc
2. Relativna vrijednost zadržavanja
Relativna vrijednost zadržavanja, također poznata kao faktor razdvajanja, omjer koeficijenta raspodjele ili faktor relativnog kapaciteta, je omjer prilagođenog vremena zadržavanja (zapremina) testirane komponente i prilagođenog vremena zadržavanja (zapremina) standarda pod određenim hromatografskim uslovima.
Relativne vrijednosti zadržavanja korištene su kako bi se eliminirao utjecaj određenih radnih uvjeta, kao što su brzina protoka i gubitak fiksatora, na vrijednosti zadržavanja.Standard u relativnoj vrijednosti zadržavanja može biti komponenta u testiranom uzorku ili jedinjenje dodano umjetno.
3. Indeks zadržavanja
Indeks zadržavanja je indeks zadržavanja supstance i koja se ispituje u fiksnoj otopini X. Dva n-alana su odabrana kao referentne supstance, od kojih jedan ima N broj ugljika, a drugi N+n.Njihovo prilagođeno vrijeme zadržavanja je t 'r (N) i t 'r (N+n), respektivno, tako da je prilagođeno vrijeme zadržavanja t 'r (i) supstance i koja se testira točno između njih, tj. t 'r (N).
Indeks zadržavanja može se izračunati na sljedeći način.
4. Faktor kapaciteta (k)
U ravnoteži, omjer mase komponente u stacionarnoj fazi (s) prema mobilnoj fazi (m), nazvan faktor kapaciteta.Formula je sljedeća:
5、Koeficijent raspodjele (K) U ravnoteži, omjer koncentracije komponente u stacionarnoj fazi (s) prema mobilnoj fazi (m), nazvan koeficijent raspodjele.Formula je sljedeća
Odnos između K i k:
Odražava bitna svojstva konstrukcije tipa stupa i njegovog čvora
kratak sažetak
Odnos između vrijednosti zadržavanja i faktora kapaciteta i koeficijenta podjele:
Kromatografsko razdvajanje se zasniva na razlici u sposobnosti adsorpcije ili rastvaranja svake komponente u fiksnom relativnom uzorku, koja se može kvantitativno izraziti veličinom koeficijenta raspodjele K (ili faktora kapaciteta k) vrijednosti.
Komponente sa jakom sposobnošću adsorpcije ili rastvaranja imaju veliki koeficijent raspodjele (ili faktor kapaciteta) i dugo vrijeme zadržavanja.Suprotno tome, komponente sa slabom adsorpcijom ili rastvorljivošću imaju mali koeficijent raspodjele i kratko vrijeme zadržavanja.
Osnovna teorija hromatografije
1. Teorija posude
(1) Iznesite -- termodinamičku teoriju
Počelo je s modelom ploče tornja koji su predložili Martin i Synge.
Frakciona kolona: u tacni za nekoliko puta ravnoteže gas-tečnost, prema tački ključanja različitog odvajanja.
Kolona: Komponente su uravnotežene višestrukim particijama između dvije faze i razdvojene prema različitim koeficijentima podjele.
(2) Hipoteza
(1) Postoji mnogo tacni u koloni, a komponente mogu brzo da dostignu ravnotežu distribucije unutar intervala ležišta (to jest, visina tacne).
(2) Mobilna faza ulazi u kolonu, ne kontinuirano već pulsirajuće, odnosno svaki prolaz je zapremina kolone.
(3) Kada se uzorak doda na svaku ploču kolone, difuzija uzorka duž ose kolone se može zanemariti.
(4) Koeficijent raspodjele je jednak na svim tacnama, nezavisno od količine komponenti.To jest, koeficijent particije je konstantan na svakom tabanu.
(3) Princip
Šematski dijagram teorije ladica
Ako se komponenta jedinične mase, odnosno m=1 (na primjer, 1mg ili 1μg), doda u tacnu br. 0, a nakon distribucijske ravnoteže, jer je k=1, odnosno ns=nm, nm=ns=0,5.
Kada zapremina ploče (lΔV) nosećeg gasa uđe u ploču 0 u obliku pulsiranja, gas nosač koji sadrži nm komponentu u gasnoj fazi gura se na ploču 1. U ovom trenutku, ns komponenta u tečnoj fazi ploče 0 a nm komponenta u gasnoj fazi ploče 1 će se preraspodijeliti između dvije faze.Dakle, ukupna količina komponenti sadržanih u ploči 0 je 0,5, u kojoj su plinovita i tečna faza svaka po 0,25, a ukupna količina sadržana u ploči 1 je također 0,5.Gasne i tečne faze su takođe bile 0,25.
Ovaj proces se ponavlja svaki put kada novi gas nosilac zapremine ploče pulsira u kolonu (vidi tabelu ispod).
(4) Jednačina hromatografske krivulje istjecanja
σ je standardna devijacija, vrijeme zadržavanja, C je koncentracija u bilo kojem trenutku,
C, je koncentracija ubrizgavanja, odnosno ukupna količina komponenti (površina vrha A).
(5) parametri efikasnosti kolone
Pri konstantnom tR, što je manji W ili w 1/2 (to jest, uži vrh), to je veći broj teoretskih ploča n, manja je teorijska visina ploče i veća je efikasnost odvajanja kolone.Isto važi i za efektivnu teoriju tray neff.Stoga je teoretski broj tacni indeks za procjenu efikasnosti kolona.
(5) Karakteristike i nedostaci
> Prednosti
Teorija posude je polu-empirijska i objašnjava oblik krivulje oticanja
Ilustrovani su procesi razdvajanja i razdvajanja komponenti
Predložen je indeks za procjenu efikasnosti kolone
> Ograničenja
Komponente ne mogu zaista postići ravnotežu distribucije u dvije faze:
Uzdužna difuzija komponenti u koloni se ne može zanemariti:
Utjecaj različitih kinetičkih faktora na proces prijenosa mase nije razmatran.
Odnos između efekta stupca i brzine protoka mobilne faze ne može se objasniti:
Nije jasno koji glavni faktori utiču na efekat kolone
Ovi problemi su na zadovoljavajući način riješeni u teoriji stopa.
2. Teorija stopa
Godine 1956., holandski naučnik VanDeemter et al.apsorbovao koncept teorije posude i kombinovao kinetičke faktore koji utiču na visinu posude, izneo kinetičku teoriju hromatografskog procesa - teoriju brzine i izveo VanDeemterovu jednačinu.On posmatra hromatografski proces kao dinamički neravnotežni proces i proučava uticaj kinetičkih faktora na širenje pika (tj. efekat kolone).
Kasnije, Giddings i Snyder et al.predložio jednačinu brzine tečne hromatografije (odnosno Gidingsova jednačina) zasnovanu na VanDeemterovoj jednačini (kasnije nazvanoj jednačina brzine gasne hromatografije) i prema razlici svojstava između tečnosti i gasa.
(1) Van Deemterova jednadžba
Gdje: H: je visina ploče
A: koeficijent termina vrtložne difuzije
B: koeficijent molekularne difuzije
C: koeficijent pojma otpora prijenosa mase
(2) Gidingsova jednačina
Kvantitativna i kvalitativna analiza
(1) Kvalitativna analiza
Kvalitativna hromatografska analiza je da odredi spojeve predstavljene svakim hromatografskim pikom.Pošto različite supstance imaju određene retencione vrednosti pod određenim hromatografskim uslovima, retenciona vrednost se može koristiti kao kvalitativni indeks.Različite hromatografske kvalitativne metode trenutno se baziraju na vrijednostima zadržavanja.
Međutim, različite tvari mogu imati slične ili identične vrijednosti zadržavanja pod istim kromatografskim uvjetima, odnosno vrijednosti zadržavanja nisu isključive.Stoga je teško okarakterizirati potpuno nepoznat uzorak samo na osnovu vrijednosti zadržavanja.Ako se na osnovu razumijevanja izvora, prirode i namjene uzorka može donijeti preliminarna procjena sastava uzorka, a za određivanje spoja predstavljenog hromatografskim pikom mogu se koristiti sljedeće metode.
1. Kvalitativna kontrola korištenjem čistih tvari
Pod određenim hromatografskim uslovima, nepoznato ima samo definisano vreme zadržavanja.Stoga, nepoznato se može kvalitativno identificirati poređenjem vremena zadržavanja poznate čiste supstance pod istim hromatografskim uslovima sa vremenom zadržavanja nepoznate supstance.Ako su ta dva ista, nepoznata supstanca može biti poznata čista supstanca;Inače, nepoznato nije čista supstanca.
Metoda kontrole čiste supstance primjenjiva je samo na nepoznatu supstancu čiji je sastav poznat, čiji je sastav relativno jednostavan i čija je čista supstanca poznata.
2. Metoda relativne vrijednosti zadržavanja
Relativna vrijednost zadržavanja α, odnosi se na prilagođavanje između komponente i i referentnih materijala Omjer vrijednosti zadržavanja:
Mijenja se samo s promjenom temperature fiksatora i stupca i nema nikakve veze s drugim radnim uvjetima.
Pri određenoj stacionarnoj fazi i temperaturi kolone mjere se prilagođene vrijednosti zadržavanja komponente i i referentne tvari s, a zatim se izračunavaju prema gornjoj formuli.Dobijene relativne vrijednosti zadržavanja mogu se kvalitativno uporediti sa odgovarajućim vrijednostima u literaturi.
3, dodavanjem poznatih tvari za povećanje metode visine vrha
Kada postoji mnogo komponenti u nepoznatom uzorku, dobijeni hromatografski pikovi su previše gusti da bi se lako identifikovali gornjom metodom, ili kada se nepoznati uzorak koristi samo za analizu određene stavke.
"Prvo se pravi hromatogram nepoznatog uzorka, a zatim se dobija još jedan hromatogram dodavanjem poznate supstance nepoznatom uzorku."Komponente sa povećanom visinom vrha mogu biti poznate po takvim supstancama.
4. Zadržite kvalitativnu metodu indeksa
Indeks zadržavanja predstavlja retenciono ponašanje supstanci na fiksativima i trenutno je najčešće korišten i međunarodno priznati kvalitativni indeks u GC.Ima prednosti dobre ponovljivosti, ujednačenog standarda i malog temperaturnog koeficijenta.
Indeks zadržavanja se odnosi samo na svojstva stacionarne faze i temperaturu kolone, ali ne i na druge eksperimentalne uslove.Njegova tačnost i ponovljivost su odlične.Sve dok je temperatura kolone ista kao temperatura stacionarne faze, za identifikaciju se može primijeniti literaturna vrijednost i nije potrebno koristiti čisti materijal za poređenje.
(2) Kvantitativna analiza
Osnova za hromatografsku kvantifikaciju:
Zadatak kvantitativne analize je pronaći stotinu komponenti u mješovitom uzorku
Frakcijski sadržaj.Hromatografska kvantifikacija se zasnivala na sledećem: kada su radni uslovi bili dosledni, bio je
Masa (ili koncentracija) mjerene komponente određena je signalom odgovora koji daje detektor
To je proporcionalno.naime:
Osnova za hromatografsku kvantifikaciju:
Zadatak kvantitativne analize je pronaći stotinu komponenti u mješovitom uzorku
Frakcijski sadržaj.Hromatografska kvantifikacija se zasnivala na sledećem: kada su radni uslovi bili dosledni, bio je
Masa (ili koncentracija) mjerene komponente određena je signalom odgovora koji daje detektor
To je proporcionalno.naime:
1. Metoda mjerenja površine vrha
Površina pika je osnovni kvantitativni podatak koji daje hromatogram, a tačnost mjerenja površine pika direktno utiče na kvantitativne rezultate.Korištene su različite metode mjerenja za hromatografske pikove s različitim oblicima pikova.
Teško je u kvantitativnoj analizi pronaći tačnu vrijednost zime:
S jedne strane zbog poteškoća u preciznom mjerenju apsolutne zapremine ubrizgavanja: s druge strane
Površina pika zavisi od hromatografskih uslova, a hromatografsku traku treba održavati kada se vrednost meri
Niti je moguće niti zgodno učiniti istu stvar.Čak i ako to možete dobro shvatiti
Tačna vrijednost i zato što ne postoji jedinstveni standard i ne može se direktno primijeniti.
2. Kvantitativni faktor korekcije
Definicija kvantitativnog faktora korekcije: količina komponenti koje ulaze u detektor (m)
Odnos njegove hromatografske površine vrha (A) ili visine vrha () je konstanta proporcionalnosti (,
Konstanta proporcionalnosti naziva se apsolutni faktor korekcije za komponentu.
Teško je u kvantitativnoj analizi pronaći tačnu vrijednost zime:
S jedne strane zbog poteškoća u preciznom mjerenju apsolutne zapremine ubrizgavanja: s druge strane
Površina pika zavisi od hromatografskih uslova, a hromatografsku traku treba održavati kada se vrednost meri
Niti je moguće niti zgodno učiniti istu stvar.Čak i ako to možete dobro shvatiti
Tačna vrijednost i zato što ne postoji jedinstveni standard i ne može se direktno primijeniti.
To jest, relativni faktor korekcije 'komponente je komponenta i referentni materijal s
Odnos apsolutnih faktora korekcije.
Može se vidjeti da je relativni faktor korekcije kada je kvalitet komponente u odnosu na standard.
Kada je supstanca s jednaka, površina vrha referentnog materijala je površina vrha komponente
Višestruko.Ako neka komponenta ima masu m i površinu vrha A, tada je broj f'A
Vrijednosti su jednake površini vrha referentnog materijala s masom od.Drugim riječima,
Pomoću relativnog faktora korekcije, površine vrhova svake komponente mogu se odvojiti
Preračunato u površinu vrha referentnog materijala jednaku njegovoj masi, zatim omjer
Standard je unificiran.Dakle, ovo je normalizirana metoda za određivanje postotka svake komponente
Osnova kvantiteta.
Metoda dobijanja relativnog faktora korekcije: vrednosti relativnog korektivnog faktora su samo upoređene sa bićem
Mjerenje se odnosi na standard i tip detektora, ali na radnu traku
Nije bitno.Stoga se vrijednosti mogu preuzeti iz referenci u literaturi.Ako tekst
Ako u ponudi ne možete pronaći željenu vrijednost, možete je i sami odrediti.Metoda određivanja
Metoda: Određena količina izmjerene supstance deset odabranih referentnih materijala → pretvorena u određenu koncentraciju
Izmjerene su hromatografske površine pikova A i As dvije komponente.
To je formula.
3. Metoda kvantitativnog izračunavanja
(1) Metoda normalizacije površine
Zbir sadržaja svih frakcija bez vrhova izračunat je kao 100% za kvantifikaciju
Metoda se zove normalizacija.Formula za njegovo izračunavanje je sljedeća:
Gdje je P,% postotni sadržaj ispitanih komponenti;A1, A2... A n je komponenta 1. Površina vrha od 1~n;f'1, f'2... f'n je relativni faktor korekcije za komponente 1 do n.
(2) eksterni standardni metod
Metoda kvantitativnog poređenja između signala odgovora komponente koja se ispituje u uzorku i čiste komponente koja se testira kao kontrola.
(3) Metoda internog standarda
Metoda tzv. internog standarda je metoda u kojoj se standardnom rastvoru ispitivane supstance i rastvoru uzorka kao internog standarda dodaje određena količina čiste supstance, a zatim analizira i određuje.
(3) standardni metod sabiranja
Standardna metoda dodavanja, također poznata kao metoda internog dodavanja, je dodavanje određene količine (△C)
Referentna ispitivana supstanca je dodana u rastvor uzorka koji se testira, a test je dodan u test
Pik otopine uzorka nakon supstance bio je veći od onog u originalnom rastvoru uzorka
Povećanje površine (△A) korišteno je za izračunavanje koncentracije tvari u otopini uzorka
sadržaj (Cx)
Gdje je Ax površina vrha tvari koja se mjeri u originalnom uzorku.
Vrijeme objave: Mar-27-2023